Doctorado en Biología

DIAZ, Marina.
"Biotecnología aplicada al mejoramiento de la calidad forrajera del pasto llorón, Eragrostis curvula (Schrad.) Nees".
Director: Carmen V. Echenique.

RESUMEN
El interés en el mejoramiento de especies forrajeras se ha centrado en unas pocas especies, como la alfalfa entre las leguminosas y el raigrás perenne y anual y la festuca alta entre las gramíneas. Sin embargo, en nuestro país existen extensas zonas que no cumplen con los requerimientos para que estas especies puedan desarrollarse, por lo que resulta necesario la implantación de otras pasturas. En este sentido el pasto llorón, Eragrostis curvula (Schrad.) Nees., ha demostrado ser una forrajera de gran utilidad desde que fuera introducida en Argentina en 1930, estableciéndose en suelos arenosos, con baja fertilidad, tolerando condiciones de sequía y pH extremos. Por estas razones se encuentra entre los mejores pastos para zonas marginales de bajo potencial productivo.
Las forrajeras de crecimiento estival presentan, en general, altos contenidos de fibra y bajos contenidos de proteína en sus tejidos cuando se las compara con forrajeras de clima templado. Esto se traduce en una baja digestibilidad y un bajo rendimiento animal. El pasto llorón como planta forrajera de origen subtropical no difiere de este modelo, por lo que en un programa de mejoramiento uno de los aspectos principales a considerar es la calidad del forraje. El presente estudio estuvo dirigido a aportar elementos para mejorar este aspecto del pasto llorón, para lo cual inicialmente se abordó el estudio de algunos de los factores que se señalan como importantes para la digestibilidad de las forrajeras, como son la lignina y la sílice. Este estudio permitió observar que, si bien ambos resultan relevantes, ninguno puede explicar por sí solo las diferencias en la digestibilidad de los genotipos analizados.
Dado que cualquier proyecto que involucre mejoramiento por técnicas biotecnológicas requiere de un sistema de cultivo in vitro, el primer paso fue desarrollar un sistema que permita la manipulación de la especie. Para ello se analizaron cuatro fuentes de explanto diferentes (inflorescencias inmaduras, embriones, semillas y base de hojas), en tres genotipos, dos cultivares apomícticos obligados (Morpa y Don Pablo) y uno apomíctico facultativo (Kromdraai). Se pudo determinar que las inflorescencias representan el mejor explanto para inducir la formación de callos embriogénicos en los tres cultivares. A partir de callos del cv. Kromdraai se iniciaron suspensiones celulares a las que se les analizó el potencial morfogénico a lo largo de los subcultivos, observándose una disminución del mismo luego de los cuatro meses de comenzado el cultivo. Debido a esto y, considerando que el cultivo de suspensiones celulares resulta costoso, demanda mucho tiempo y que períodos prolongados de cultivo in vitro pueden generar cambios genéticos se propone al cultivo inflorescencias y a los callos obtenidos a partir del las mismas como tejido blanco para los experimentos de transformación por el método biolístico.
Posteriormente, y a partir de los antecedentes existentes en la manipulación de la lignina en otras especies de forrajeras como Lolium perenne, Festuca arundinacea y Medicago sativa, se construyeron y analizaron genotecas de expresión en las que se pudieron identificar tres de las enzimas involucradas en la biosíntesis de este polímero. Dos de estas enzimas, la O-metiltransferasa del ácido cafeico (COMT) y la cafeoil CoA O-metiltransferasa (CCOMT), son consideradas clave para la manipulación tanto de la cantidad como de la calidad de la lignina. Los clones que portaban los fragmentos correspondientes a los genes para estas enzimas fueron separados y los fragmentos secuenciados completamente. Estas secuencias se utilizaron para compararlas y establecer su homología con otras depositadas en la base de datos del GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Las mismas se utilizarán en el futuro en experimentos tendientes a manipular la vía de biosíntesis de lignina.
Con el objetivo de poner a punto una metodología de transformación para Eragrostis curvula por biolística se evaluaron distintas variables, tanto físicas como biológicas, mediante la expresión transiente del gen uidA, determinándose las condiciones más favorables para la transformación. Por otro lado se realizaron experimentos tendientes a lograr la transformación estable a partir de la incorporación de un gen de selección como el hph, que confiere resistencia al antibiótico Higromicina, para lo cual previamente se estudió la resistencia natural de la especie al mencionado antibiótico.
Si bien no se logró la expresión estable del gen hph, este estudio permitió establecer las condiciones necesarias para hacerlo en un futuro cercano: se cuenta con un sistema de cultivo in vitro apropiado, las condiciones de bombardeo y la secuencia parcial de genes que codifican para dos enzimas clave de la vía de biosíntesis de lignina. Esto permitirá el establecimiento de un sistema de ARNi para regular negativamente su expresión.

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